Chromatografie jsou fyzikálně-chemické separační metody, jejichž podstatou je rozdělování složek směsi vzorku mezi dvě fáze, a to fázi nepohyblivou (stacionární fázi) a pohyblivou (mobilní fázi). Tyto dvě fáze se od sebe odlišují některou základní fyzikálně chemickou vlastností, např. Spolu s pohybující se mobilní fází je soustavou unášen také vzorek. Dělené složky vzorku (analyty) interagují v různé míře se stacionární a mobilní fází. Analyty, které se poutají více ke stacionární fázi, se pohybují pomaleji a jsou zadržovány déle, než analyty, které se ke stacionární fázi poutají méně. Na základě tohoto principu dochází k rozdělení složek směsi.
Eluční roztok/činidlo - kapalina, kterou promýváme chromatografickou kolonu během vlastního dělení u sloupcových chromatografií za účelem vymývání frakcí vzorku z kolony. Eluční činidlo je vždy mobilní fází, ne všechnu mobilní fázi však můžeme považovat za eluční činidlo. Chromatograf - zařízení, umožňující chromatografii. Skládá se z několika součástí. Kapalinový chromatograf vždy obsahuje zařízení pro uchovávání a transport mobilní fáze (vysokotlaké čerpadlo = pumpu), zařízení pro dávkování vzorku (dávkovač, autosampler), zařízení pro separaci látek (chromatografická kolona) a zařízení pro detekci látek. Volitelné součásti chromatografu jsou odplyňovač mobilní fáze, termostat kolony, sběrač frakcí, u gradientové eluce směšovač mobilních fází.
Mobilní fáze - kapalina nebo plyn, které unášejí složky dělené směsi přes tzv. nosič - pevná, z hlediska dělení pokud možno inertní látka, se kterou je spojena zakotvená fáze. Retenační faktor - je poměr vzdálenosti čela od startu a vzdálenosti středu skvrny sledované látky od startu při plošných chromatografiích. U plošných chromatografií je však reprodukovatelnost sporná a proto se s tabelací RF nesetkáváme. Retenční/eluční čas nebo objem - čas od začátku eluce, který je potřebný k tomu, aby se daná frakce vzorku dostala k detektoru za kolonou, nebo objem elučního činidla, který proteče za eluční čas kolonou. Jsou-li použity dobře definované kolony, hovoříme o teoretických patrech a účinnosti kolony. U ionexové a afinitní chromatografie mluvíme spíše o kapacitě kolony. Zakotvená fáze - vrstva kapaliny relativně pevně spojená s pevnou látkou, která tvoří stacionární fázi a na kterou se látky silněji vázané adsorpčními silami častěji a déle adsorbují.
Sorbenty, používané v adsorpční chromatografii jako stacionární fáze, se liší svou polaritou. Extrémně nepolárním sorbentem je aktivní uhlí a uhlíkové sorbenty. Z polárních kyselých sorbentů je silikagel, z polárních bazických pak hydratované oxidy hliní a hořečnatý. Často se používají organické (ko)polymery různých složení. Mobilní fázi vybíráme z eluotropní řady rozpouštědel: pentan, hexan, chloroform, ethanol, kyselina octová, voda. Často se ukazují různě směsné eluenty.
Je založena na rozdílné rozpustnosti dělených látek ve dvou kapalinách; jedna kapalina je mobilní fází a druhá je zakotvena na nosiči. Pokud jsou kapaliny vzájemně nemísitelné, stačí k zakotvení interakce nevazebného typu. Jinak je třeba chemická vazba. U plynové chromatografie je mobilní fáze plyn. Dělené látky, které vykazují vyšší rozdělovací koeficient, jsou stacionární fázi více zdržovány a mobilními fází jsou unášeny pomaleji. Pokud je zakotvená fáze voda, mluvíme o chromatografii s normální fází; pokud jsou organické kapaliny s nízkou polaritou - obrácené fázi.
V chemických systémech s ionexovou chromatografií se vysvětluje, že interakce iontu či dipólu s ionexem roste s jeho nábojem. Ionexy - stacionární fáze, se skládají z aniontových a kationtových skupin na nosiči. Nejčastějšími skupinami na anexu jsou primární, sekundární a terciární aminy, a na katexu kyselé skupiny jako hydroxyl, karboxyl, fosfát a sulfát. Vlastní skelet ionexu může být organický (dextrans, celulóza) či anorganický (zoelit, fosforečnany). Mobilními fázemi bývají vodné roztoky. Eluce bývá prováděna vytěsněním nebo změnou náboje (přenábojováním). Gradientová eluce umožňuje postupné eluování složek. Při pH klesá prográdně a složky eluují podle izoelektrických bodů.
Frakcionace založená na velikosti částic umožňuje gelová permeační chromatografie (GPC) - používá se pro vysokomolekulární látky, zejména bílkoviny. Stacionární fáze bývá kuličková s tunýlky různých velikostí; největší částice putují nejrychleji, nejmenší nejpomaleji. Při výběru kolony musí být zohledněn rozsah molekulových hmotností v vzorku. Podle polarity rozlišujeme hydrofilní a hydrofobní systémy; většina je hydrofilní a využívá polysacharidové skeletony kolony a vodné roztoky jako mobilní fázi. Gelová permeační chromatografie bývá někdy mylně označována molekulární filtrací.
Podle nosičů a interakcí se dělí i na kombinace adsorpční, hydrofobní a ion-ex chromatografie. V adsorpční chromatografii jsou hlavními nosiči silikagel, aktivní uhlí a různé polymerové materiály; v gelové chromatografii nosiče často tvoří polysacharidové gely. Příkladem přípravy sorbentu pro afinitní chromatografii je aktivace nosiče a navázání ligandu; stacionární fáze je poté navázána nevazebnými interakcemi a eluce probíhá změnou pH či pufrů. Afinitní chromatografie umožňuje selektivní izolaci cílových molekul podle specifických interakcí ligandu s analytem.
V systému GC je nosný plyn inertní - nejčastěji dusík, helium pro lepší dělící schopnost, i když je dražší. Vlastní chromatografická kolona může být plněná (nPlněněné kolony) nebo kapilární (capillary columns). Inlet je vyhřívaný pro rychlé zplynění vzorku a dávkovací systém zahrnuje dávkovací smyčku a port pro injektáž vzorku. Nástřikové typy a těsnost portu jsou klíčové pro opakovatelnost výsledků. Kolony mohou být naplněné částicemi nebo kapilární, trubice různých délek a průměrů, a temperování kolony určuje lineární rychlosti a retenční časy.
Detektory GC se liší konstrukcí a principem; většina je provozována při vysokých teplotách, což vyžaduje čistotu plynů, aby nedošlo k oxidaci a poškození detektoru. GC často doplňují další techniky (např. GC/MS) pro identifikaci složek na základě hmotnostního spektra. Příprava vzorků, injektáž a monitorování plynů jsou klíčové pro spolehlivost analýz.
V závěru je klíčové vybrat vhodnou kolonovou fázi, konferenci a podmínky eluce tak, aby rozdělení odpovídalo cílovým složkám a aby detektory a nosný plyn zajišťovaly kvalitu analýzy.